PCR實(shí)驗(yàn)代測(cè)準(zhǔn)備工作
PCR實(shí)驗(yàn)代測(cè)有三步：抽提RNA，RT，PCR。
試驗(yàn)前注意：
1.做RT前必需測(cè)RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄體系對(duì)RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。
2.RT按要求做，一般不會(huì)出太大問題。
3.PCR如需擴(kuò)長(zhǎng)片段，則對(duì)前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2+濃度、退火溫度能解決的。
實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備：
1、塑料制品：(包括槍頭、EP管、勻漿管等)先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制品逐個(gè)浸泡其中，其中小槍頭需要吸管打入DEPC水，過夜，然后高壓，再烤干備用，實(shí)驗(yàn)前將槍頭等放入吸頭臺(tái)，再高壓一次(EP管)。
2、玻璃制品：泡酸過夜，沖洗干凈，蒙錫紙烤干備用(DEPC水泡)(洗凈后先泡1‰DEPC過夜，再烤干)。
3、勻漿器：(包括剪刀、鑷子)先洗凈后，再高壓(不需要泡DEPC
試驗(yàn)試劑：
1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中靜置4小時(shí)備用。
2、75%乙醇：用無水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高壓)。
3、異丙醇：放入棕色瓶中。
4、lu仿：放入棕色瓶中。
5、瓊脂糖
注意事項(xiàng)：
1、逆轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵步驟是立即冰水浴。
2、Rt時(shí)，先打開PCR預(yù)熱30分鐘。
3、RNA抽提前，打開離心機(jī)預(yù)冷。
4、在所有RNA實(shí)驗(yàn)中，關(guān)鍵的因素是分離得到全長(zhǎng)的RNA。而實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。在實(shí)驗(yàn)中，一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。
5、做RT前必需測(cè)RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄體系對(duì)RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。
6、RT按要求做，一般不會(huì)出太大問題。
7、PCR，按常規(guī)。但如需擴(kuò)長(zhǎng)片段，則對(duì)前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2+濃度、退火溫度能解決的。
8、注意避免有毒、有害試劑傷害自己和他人：lu仿、溴化乙錠(EB)、酚、異硫氰酸胍、紫外線等
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更新時(shí)間：2018-06-25 
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