本研究以農(nóng)藥三唑磷及克百威為研究對象，采用分子模擬方法對其半抗原分子進(jìn)行了設(shè)計并合成得到了兩種優(yōu)化的三唑磷半抗原兩種半抗原O-乙基，O-[1-苯基-（H-1,2,4-三唑-3-基），N-（3-羧基-丙基）]硫代磷酸胺（THBu）、O-乙基，O-[1-苯基-（H-1,2,4-三唑-3-基）,N-（5-羧基-丙基）]硫代磷酸胺（THHe）和一種克百威半抗原4—[[（2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧）羰基]氨基]丁酸（BFNB）。上述半抗原分別與載體蛋白偶聯(lián)制備成人工抗原，免疫小白鼠，再采用雜交瘤技術(shù)制備出了對應(yīng)單克隆抗體。經(jīng)測定，抗體（腹水）的效價均在10~6以上，與對應(yīng)農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率均較低，表現(xiàn)出很高的特異性。 在此基礎(chǔ)上，通過對固相載體、包被緩沖液、有機溶劑、包被條件、洗滌次數(shù)、酶的種類、封閉物種類、點板時間、工作濃度、穩(wěn)定劑以及不同ELISA模式等因素的篩選比較，優(yōu)化了三唑磷和克百威ELISA方法和條件。優(yōu)化后結(jié)果顯示：Costar酶標(biāo)板（美國）吸附效果和均一性較好；抗體以PBS（pH 7.4，0.01M）作為包被介質(zhì)較為理想，人工抗原則以CBS（pH 9.5，0.05M）作為包被介質(zhì)較為理想；包被條件以在37℃下包被2h效果為佳；反應(yīng)介質(zhì)加入2％牛奶可減少非特異性吸附，提高檢測靈敏度；有機溶劑中甲醇對ELISA反應(yīng)的影響較小，反應(yīng)體系中zui終含量10％為佳；HRP酶作為顯色反應(yīng)的催化劑比AP酶更為理想；包被抗原直接競爭ELISA模式OD值的平行性不如包被抗體直接競爭ELISA模式的好；優(yōu)化出的穩(wěn)定劑可使包被在酶標(biāo)板上的抗體在37±1℃條件下保存14天而抗體活性基本保持不變。 利用優(yōu)化后的分析條件，建立了農(nóng)藥三唑磷異源直接競爭ELISA方法（包被抗體模式）和克百威直接競爭ELISA方法（包被二抗模式）。在考察了不同樣品基質(zhì)對ELISA方法的影響后，進(jìn)一步對蔬菜樣品、水果樣品、水、土等環(huán)境樣品進(jìn)行了三唑磷和克百威添加回收率試驗，檢測結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計分析，考察了方法的準(zhǔn)確度與精密度，并對不同處理組間、相同處理組板間的檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行了顯著性檢驗，確定了不同樣品的方法本底值、zui低檢測限及檢測結(jié)果陰性／陽性判定方法，zui終構(gòu)建了三唑磷ELISA快速測定試劑盒和克百威ELISA快速測定試劑盒。結(jié)果表明，三唑磷ELISA方法的檢測靈敏度達(dá)到了2.66 ng／mL（檢測線性范圍為1.95-2000ng／mL），克百威ELISA方法的檢測靈敏度為0.97 ng／mL（檢測線性范圍為0.8-340 ng／mL），實際樣品中的zui低檢測限達(dá)到或接近（部分超過）了一些國家和地區(qū)的殘留*（MRL）標(biāo)準(zhǔn)。 通過本課題的研究，在國內(nèi)外研制出了三唑磷半抗原、抗三唑磷單克隆抗體及其ELISA試劑盒；在國內(nèi)研制出了抗克百威單克隆抗體及其ELISA試劑盒；在國內(nèi)系統(tǒng)建立了農(nóng)藥等小分子化合物ELISA快速測定試劑盒國產(chǎn)化生物試劑的技術(shù)體系。試制的試劑盒產(chǎn)品經(jīng)農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所、農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（天津）、等5家檢測機構(gòu)應(yīng)用，證明該技術(shù)可靠，產(chǎn)品質(zhì)量和性能穩(wěn)定，可用于指導(dǎo)生物試劑。（轉(zhuǎn)自 論文網(wǎng)）