原位雜交（組織芯片）

服務(wù)介紹：

原位雜交原理：原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知序列核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交，從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進行。原位雜交亦可以應(yīng)用于組織芯片的檢測。結(jié)果更豐富，更具有對比性。

實驗流程：

1、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

2、消化：根據(jù)組織固定時間長短，切片于修復(fù)液中煮沸10-15分鐘，自然冷卻。后基因筆畫圈，根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20-30 min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。

3、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：滴加3%甲醇-H2O2，室溫避光孵育15min，將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

4、預(yù)雜交：滴加預(yù)雜交液，37°C孵育1h。

5、雜交：傾去預(yù)雜交液，滴加含探針雜交液, 恒溫箱 37度雜交過夜。

6、雜交后洗滌：洗去雜交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多，可以增加甲酰胺洗滌。

7、滴加封閉液：滴加封閉血清 BSA。室溫30min。

8、滴加鼠抗地-高辛標(biāo)記過氧化物酶(anti-DIG-HRP)：傾去封閉液，滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育40min，后PBS洗4次×5min。

9、DAB顯色：切片稍甩干后，在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，純水沖洗切片終止顯色。

10、復(fù)染細胞核：Harris蘇木素復(fù)染3min左右，自來水洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水洗，氨水返藍，流水沖洗。

11、脫水封片：將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精I 6min—100%酒精II 6min-正丁醇6min—二甲苯透明，將切片從二甲苯中拿出稍晾干后，中性樹膠封片。

15、顯微鏡檢，圖像采集分析。 

結(jié)果判讀：

陽性為棕黃色，細胞核為藍色。

送樣要求：

1、切片前處理要求：新鮮組織干冰運輸后做冰凍切片；或取2mm左右厚度的新鮮組織，5min內(nèi)投入原位雜交固定液內(nèi)固定，4℃低溫保存運輸，切勿冷凍結(jié)冰，盡快包埋切片后進行原位雜交實驗，固定時間過長影響核酸檢出率；

2、冰凍切片：冰凍切片-20℃運輸；

3、石蠟切片：石蠟切片常溫運輸；

4、細胞爬片：細胞爬片加原位雜交固定液固定15min后，換無酶PBS，密封，4℃運輸。

單據(jù)填寫：

1、探針合成：需提供待測目的基因序列或基因登錄號、所需標(biāo)記類型；

2、自帶探針需告知完整探針信息；

3、寫明檢測要求。